高维流式如何贯穿单细胞与空间组学研究？

一、组织样本多组学研究的常见痛点

如果您正在或准备采用单细胞转录组（scRNA-seq）联合空间转录组（Visium）等检测组织样本，以下场景您一定不陌生：

• 面对动物模型众多时间点，如何精准定位关键细胞亚群的产生峰值，避免 scRNA-seq 错失核心发现？
• 面对近十个 Cluster 和上百个 DEGs，该如何筛选具有核心功能意义的亚群和机制探究的功能指标？
• scRNA-seq 与空间转录组揭示的高表达基因，为何在流式、mIF 等蛋白层验证时难以重现？

上述问题的答案，可在一篇发表于 Immunity、由维尔凯技术团队解读的七步法逻辑决策链中得到系统回应。这套逻辑决策链不仅是该研究论文的核心发现路径，更为组织免疫、巨噬细胞异质性及再生医学领域提供了一个清晰、可复制的高维度研究范式。在该研究中，高维流式细胞术是连接转录组与空间组的关键环节，也是功能验证阶段解析细胞功能异质性的关键技术之一。

二、七步法逻辑决策链总览

2025 年，Immunity 发表了题为Spatially restricted and ontogenically distinct hepatic macrophages are required for tissue repair的研究[1]。该研究揭示，肝脏损伤后，除招募型脂质相关巨噬细胞（LAMs）外，一部分驻留库普弗细胞（Kupffer cells, KCs）也会获得 LAM 样表型（LAM-like KCs），两类细胞共同参与组织修复，且这一修复功能依赖 TREM2 介导的凋亡细胞清除（胞葬作用）。我们将其核心发现路径提炼为七步法逻辑决策链：

流式表型筛查 → scRNA-seq 发现 → 流式验证关键亚群 → 空间转录组 + mIF 定位 → 谱系示踪溯源 → 机制探究 → 功能验证

在七步法逻辑决策链中，高维流式细胞术贯穿始终：它既是锁定取材窗口与目标细胞群的研究起点，也是衔接转录组发现与空间组定位的关键枢纽，更是功能验证阶段实现单细胞水平功能定量的核心技术平台。

三、逐层拆解：七步法中的流式决策中枢价值

第一步：流式表型筛查——锚定时空动力学坐标

科学问题：急性肝损伤（APAP）后，复杂的免疫微环境如何演变？何时才是捕捉细胞状态转换的黄金窗口？

关键发现：通过流式动态监测肝组织髓系细胞亚群数量发现，中性粒细胞在 24h 招募达峰后下降，单核细胞在 36h 达到招募高峰，而修复核心亚群（non-KCs）在 48–72h 显著增加，驻留 KCs 数量保持动态稳定。

流式决策价值：拒绝随机采样或盲从文献，利用流式数据确证 24h、48h、72h 为 scRNA-seq 的核心采样点，完整覆盖从损伤触发到炎症高峰再到修复启动的全病理周期；流式的表型筛查确保了后续昂贵的 scRNA-seq 能精准捕捉到最为丰富、最具生物学意义的细胞瞬态信息。

第二步：scRNA-seq 发现——无偏鉴定关键 Cluster 与 DEGs

科学问题：在损伤微环境中，哪些特定的细胞亚群（Cluster）主导了修复进程？支撑其功能状态的关键差异基因（DEGs）有哪些？

关键发现：通过 scRNA-seq 与 CITE-seq，精准识别出具有修复潜质的 LAMs（招募型）与 LAM-like KCs（组织驻留型），并提取以 TREM2、CD36、GPNMB、MMP12 为核心的修复相关 DEGs，为后续蛋白质水平验证提供精准导航。

流式决策价值：流式富集 CD45⁺ 免疫细胞及 Lineage⁻ 髓系细胞，可有效排除实质细胞干扰，提升 scRNA-seq 中目标群体的检测分辨率，避免稀有亚群被背景数据淹没。

第三步：流式验证关键亚群——实现生信发现向生物学事实的跨越

科学问题：scRNA-seq 定义的 Cluster 与 DEGs 在蛋白质水平真实存在吗？能否在不同疾病模型中复现？

关键发现：流式作为鉴定细胞亚群身份的关键手段，跨越了 RNA 与蛋白的非线性鸿沟，在急性损伤（APAP）、慢性纤维化（CCl₄）、代谢脂肪肝（CDA-HFD）等多个肝脏疾病模型中一致性地捕捉到 LAM-like KCs 的蛋白表型——CD36⁺CD11c⁺/⁻。

流式决策价值：流式不仅确证了亚群的存在，更筛选出了具有表型鲁棒性（Robustness）的标记物组合。所谓表型鲁棒性，指一个细胞亚群的鉴定特征（标志物组合）在不同病理模型、不同时间窗口、甚至不同检测平台下，都能保持高度一致、可识别、且不消失。作者通过流式验证了 LAM-like KCs 的表型鲁棒性——无论肝脏因药物中毒、化学诱导还是营养过剩导致损伤，这群修复细胞始终稳定表达 CD36，证明其并非某种特定损伤下的特殊产物，而是肝脏面对各种压力时巨噬细胞发生修复转化的普遍规律。

第四步：空间转录组 + mIF 定位——组织微环境定位还原

科学问题：目标亚群在组织中的空间分布及其与病理病灶的拓扑关系如何？

关键发现：Visium 显示 MMP12 信号富集于中央静脉区，mIF 显示 LAM-like KCs（CLEC4F⁺TREM2⁺）细胞精准定位于坏死龛边缘。

流式决策价值：流式预验证 TREM2/CLEC4F 等标志物的蛋白表达鲁棒性，为 mIF 提供经验证的抗体组合，规避 RNA–蛋白不一致导致的假阴性；流式定义的亚群丰度与表型特征直接指导 mIF 设计，实现从单细胞数据到组织原位图像的高保真映射。

第五步：谱系示踪溯源——细胞起源解析

科学问题：LAMs 和 LAM-like KCs 来源于循环招募还是组织驻留？

关键发现：通过骨髓嵌合和 tdTomato 示踪模型交叉验证，证实 LAMs 严格依赖单核细胞募集（CCR2 依赖性），而 LAM-like KCs 则由驻留 KCs 直接原位转化。

流式决策价值：结合 Ms4a3-Cre 示踪等模型与高维流式，在单细胞水平同步同管检测细胞来源（谱系）与活化状态（CD36/TREM2），实现谱系与表型的解耦；流式数据进一步证实，损伤微环境可驱动不同发育起源的细胞获得趋同表型与功能，为后续功能冗余研究奠定逻辑基础。

第六步：机制探究——表型转化的驱动因素

科学问题：KCs 为何获得 LAM 表型？驱动修复表型的关键信号是什么？

关键发现：体内体外实验证实，凋亡细胞摄取（胞葬作用，efferocytosis）驱动募集单核细胞与驻留 KCs 共同向修复型表型发生转录重编程。

流式决策价值：无需流式分选，高维流式可在细胞混合池中精准圈定目标亚群，实现表型与功能标志物的同步同管检测，规避体外实验操作引入的细胞应激改变；采用 tdTomato 荧光标记技术，将体内巨噬细胞摄取凋亡细胞的生物学行为转化为高通量、可重复的流式定量参数，为机制研究提供客观证据。

第七步：功能验证——验证机体修复的双保险策略

科学问题：TREM2 在两群巨噬细胞中是否必需？功能是否冗余？

关键发现：单独敲除 LAMs 或 LAM-like KCs 上的 TREM2，均未诱发灾难性的修复障碍，揭示肝脏内部存在显著的修复补偿机制；只有当通过遗传学手段同时阻断 LAMs 和 LAM-like KCs 的 TREM2 时，肝脏修复才彻底瘫痪。

流式核心价值：流式通过对多重缺陷模型下细胞功能的分析，深度解析了免疫系统如何通过亚群间的功能重叠来确保组织再生的鲁棒性。

四、高维流式在组织样本多组学研究中的作用

综合上述七步，高维流式在组织样本多组学研究中承担着不可替代的枢纽角色：

• 单细胞分辨率蛋白质水平检测的关键手段。高维流式具备单细胞分辨率、蛋白质直接检测、超高通量（单样本可检测 10⁵–10⁶ 个细胞）及多参数检测能力，是可在大规模样本中同步解析细胞身份与功能蛋白的核心技术。
• 体内功能异质性的近原生解码。mRNA 反映功能潜力，蛋白质水平与吞噬活性等才是功能输出。高维流式直接量化真实体内环境下的细胞功能状态，避免分选后 Bulk 检测抹杀异质性、丢失稀有信号，更贴近生物学第一现场。
• 临床转化的关键验证环节之一。任何具临床价值的组学发现，最终须回归单细胞蛋白水平验证。流式凭借临床检验的高普及度与标准化能力，成为验证疾病相关亚群诊断价值及药物靶点潜力的必经之路。

五、结语

七步法逻辑决策链的核心在于：以高维流式解析表型、追溯起源、量化功能，建立一套将生信发现与细胞功能深度耦合的标准化研究范式。该策略不仅适用于肝脏，亦可平行迁移至肿瘤微环境、神经炎症、肺纤维化等复杂组织异质性研究。

南宁维尔凯生物提供全流程高维流式解决方案，涵盖组织样本高维流式检测、组学数据正交验证、高维谱系示踪与近原生（near-native）功能解析，致力于以高水平高维流式技术服务，助您在复杂的组织异质性中建立可复核、可追溯的因果证据链。

参考文献

图表说明：图 1 为本文基于文献研究思路绘制的思维导图；其余插图均引自 De Ponti et al. 2025（Immunity，DOI: 10.1016/j.immuni.2025.01.002）原文公开图表，仅作学术解读用途，图表版权归原刊所有。

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本文由维尔凯公司综合项目实践，对权威文献进行解读，由人工审核 · AI 辅助润色和排版