摘要：在体外细胞模型（如 RAW264.7、BMDM 等）中，即使给予相同的促炎或促死亡刺激，细胞依然会分化出显著的单细胞死亡异质性。传统 Western blot（WB） 依赖全细胞样本匀浆，反映的是全细胞样本累积终点，难以回答多细胞死亡通路共激活（如 PANoptosis 样表型）是否发生在同一个细胞内。通过将 Cell 标杆文献（BMDM 细胞） 与维尔凯在 RAW264.7 细胞系的实测数据进行对比，验证了维尔凯细胞死亡流式检测体系能够在细胞死亡早期/细胞裂解前期，分辨 MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白，Mixed Lineage Kinase Domain-Like protein）膜易位、GSDME-NT / GSDMD-NT（Gasdermin E / Gasdermin D 氨基端活性片段）、活化型 Caspase-3（cleaved caspase-3）及铁死亡相关 GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶 4，以 MFI 表征）等细胞死亡表型。数据更揭示了 RAW264.7 中以单阳性和双阳性为主、极少三阳性的异质性表型。维尔凯依托生物学机制驱动的四层标志物体系，为课题组提供细胞死亡的高维流式技术服务，赋能 2027 国自然申报与高水平期刊成果发表。
2021 年发表于 Cell 的标杆性研究（Karki et al., Cell, 2021）报道，TNF-α 与 IFN-γ 协同作用可在骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中诱导 PANoptosis（一种同时涉及细胞焦亡、细胞凋亡与坏死性凋亡多条途径的炎性细胞死亡）。该文献主要通过 WB 展示了全细胞裂解物中活化型 Caspase-3（cleaved caspase-3）、GSDMD-NT 及磷酸化 MLKL（p-MLKL）的表达。该 WB 面板同步展示了 GSDMD、GSDME、CASP1、CASP3、CASP7、CASP8、CASP9 及 pMLKL、pRIPK1 的激活（图 1），直观反映 PANoptosis 涉及细胞焦亡、细胞凋亡与坏死性凋亡多条通路的共激活。
为验证流式检测细胞死亡技术体系在细胞模型中的可行性与创新性，维尔凯技术团队在 RAW264.7 细胞系中建立了多色流式检测 Panel，并获得清晰的单细胞实测数据：
实测响应与异质性表型分布：在 TNF-α + IFN-γ 联合处理 24 小时后，高维流式在 RAW264.7 活细胞门（Live Gate）内捕捉到剂量依赖的死亡梯度激活（图 3）。与对照组（cleaved caspase-3+ 1.29%、GSDME-NT+ 0.49%、MLKL 膜易位（MLKL-mem）+ 0.58%）相比，低浓度组（Low，TNF-α 25 ng/mL + IFN-γ 50 ng/mL）主要诱导细胞焦亡（GSDME-NT+ 6.05%）与坏死性凋亡（MLKL-mem+ 3.63%），而细胞凋亡未明显升高（cleaved caspase-3+ 0.80%）；高浓度组（High，TNF-α 50 ng/mL + IFN-γ 100 ng/mL）则三条死亡通路同时激活——cleaved caspase-3+ 升至 10.07%、GSDME-NT+ 7.84%、MLKL-mem+ 4.71%。深度多色分析显示，群落以单阳性表型为主，并出现双阳性表型（如 GSDME-NT+ MLKL-mem+），而三阳性表型（cleaved caspase-3+ GSDME-NT+ MLKL-mem+）极低（≤0.01%），提示三条死亡通路在同一细胞内同时激活极为罕见（图 4、图 5）。
MFI（荧光强度）的定量变化：MFI 数据显示，与对照组相比，处理组单个细胞内抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达量（Median 值）显著下调（control 1204 → Low 996、High 1097），焦亡执行蛋白 GSDME 与坏死性凋亡执行蛋白 MLKL 的 MFI 亦显著下降（GSDME：1230 → 471/381；MLKL：802 → 459/455），提示执行蛋白向膜易位/打孔的功能转化；而凋亡执行蛋白 cleaved caspase-3 的 MFI 在 High 组升高（424 → 614），与凋亡通路的激活一致。MFI 的升降从单细胞蛋白丰度层面印证了细胞存活缓冲垫的减弱与死亡执行程序的启动。
对比 Cell 文献中的 BMDM 数据与维尔凯实测的 RAW264.7 数据，为何后者呈现单/双阳性为主、极少三阳性的特征？
发育与遗传背景差异：BMDM 作为终末分化的原代巨噬细胞，对 TNF-α + IFN-γ 高度敏感，多种细胞死亡通路可被同时触发；而 RAW264.7 是无限增殖的细胞系，内源性抗凋亡蛋白（如 Bcl-2、c-FLIP）基线较高，且存在 RIPK3/MLKL 表达量的表观遗传调控（高甲基化，Hypermethylation）及 ASC 衔接蛋白缺失。因此，RAW264.7 的死亡轨迹更偏向 Caspase-8/3 驱动的 GSDME 介导细胞焦亡或细胞凋亡，坏死性凋亡（MLKL-mem）激活受到限制。
体系验证的科学价值：实测数据的核心价值在于验证了该流式检测体系能够分辨 MLKL-mem阳性、GSDME-NT / GSDMD-NT 活性阳性、活化型 Caspase-3 阳性等细胞死亡表型。即使在细胞死亡抗性较强的细胞系样本中，流式仍能单细胞水平解析细胞死亡表型的分化，提示流式在单细胞分辨率解析细胞命运决定（Cell Fate Decision）中的独特价值。
针对细胞模型中的细胞死亡检测，高维流式细胞术相比传统 WB，在以下 5 个维度体现出分辨能力：
若 WB 测出裂解物中活化型 Caspase-3、GSDMD-NT 与 p-MLKL 均为阳性，存在两种不同的生物学可能：A. 部分细胞发生细胞凋亡和或部分细胞发生细胞焦亡和或部分细胞发生坏死性凋亡（群体混合效应）；B. 同一个细胞内同时激活了多种细胞死亡程序（PANoptosis 样表型）。WB 匀浆因破坏单细胞完整性而难以区分；高维流式通过单细胞门控（Gating）和活细胞门控，在单个细胞上共分析多个细胞死亡关键执行分子，是单细胞水平解析多细胞死亡通路共激活较为直接的手段之一。
WB 提取的是包含培养上清中已完全裂解的死细胞 + 贴壁活细胞的总裂解物，反映的是终末累积效应（Cumulative End-point）。而高维流式通过限定 Live 活细胞门，测量的是处于细胞死亡早期/细胞裂解前期（细胞膜尚未彻底崩解、但已启动死亡程序）的细胞群。
为何研究细胞死亡早期/细胞裂解前期能更准确地解析细胞死亡机制？一旦细胞进入晚期崩解，细胞内成分释放、酶类非特异性降解以及膜结构彻底破坏，会导致信号混杂；而在细胞死亡早期/细胞裂解前期，细胞膜保持完整，上游启动分子与下游执行蛋白（如 MLKL-mem、GSDME-NT / GSDMD-NT 活性分子）处于较清晰的复合物组装与信号转导状态。在此阶段捕捉单细胞蛋白改变，有助于追溯驱动细胞走向特定死亡途径的早期事件，降低晚期死细胞崩解带来的杂音干扰。
完全破膜的晚期死细胞（Necrotic/Dead cells）由于胞质暴露与内部电荷改变，会非特异性吸附单克隆抗体。流式通过引入可固定 Viability Dye 限定 Live Gate，将晚期死细胞剔除，从而降低非特异性吸附带来的假阳性，提升捕获到的 MLKL-mem与活性分子信号的生物学特异性。
WB 的灰度值仅代表群体总体平均改变。流式数据中的直方图（Histogram）联合 MFI分析可区分细胞群体的应答模式：单峰渐进平移（Rheostat Model）提示全群细胞发生较均一的渐进式响应（如促存活蛋白 Bcl-2 的渐进降解）；而双峰分离（Bimodal Distribution）则揭示细胞命运呈现全或无的分化（Switch-like Model，如部分细胞彻底激活细胞死亡，部分细胞维持抵抗）。
在细胞模型中，不同实验技术处于不同的证据层级：WB 提供全体系蛋白积累证据；高维流式则直接测定 MLKL-mem、GSDME-NT / GSDMD-NT 活性片段及活化型 Caspase-3，深入到蛋白质功能终态层级，构建从上游启动器/调节分子（如 Caspase-8、NLRP3、Bcl-2）到下游执行分子的单细胞证据链。
在细胞模型中研究铁死亡（Ferroptosis）时，由于缺乏特异性的执行分子效应蛋白，传统 WB 仅能通过检测全细胞裂解物中 GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶 4）或 SLC7A11（溶质载体家族 7 成员 11）的蛋白总量变化趋势表征。
在单细胞水平研究铁死亡时，高维流式细胞术具有以下优势：
| 评价维度 | Western Blot (WB) | 高维流式细胞术（维尔凯细胞死亡流式Panel） |
|---|---|---|
| 证据层级 | 群体蛋白累积证据 | 单细胞蛋白质功能终态证据 |
| 分辨率 | 群体平均（Bulk Average） | 单细胞分辨率 |
| 检测标志物 | 全细胞裂解物活性片段总量 | 特定死亡通路执行蛋白（MLKL-mem / GSDME-NT 活性片段 / 活化型 Caspase-3 / GPX4） |
| PANoptosis 样表型解析 | 仅能提示群体存在多种活性片段，难以区分单细胞共激活 | 可解析单个细胞内多通路共表达与异质性分化（单/双/三阳性） |
| 死细胞噪音干涉 | 包含死细胞裂解物片段 | Live Gate 剔除晚期死细胞非特异电荷吸附 |
| 捕获时间窗口 | 终末累积终点（End-point） | 细胞死亡早期/细胞裂解前期（Pre-lytic Execution Stage） |
| 铁死亡解析 | 全细胞 GPX4 表达量升降 | 单细胞定量铁摄取-脂质氧化-氧化还原三轴 MFI + 多通路共测 |
| 应答模式分析 | 灰度条带相对比值 | 百分比 (%) + MFI (中位数) + Histogram (单峰平移/双峰分化) |
南宁维尔凯生物科技有限公司专注于高维流式细胞术在细胞死亡与免疫学领域的深度应用。我们依托机制 Panel 设计与严格质控，为广大科研工作者提供高质量的技术服务：
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