摘要：在实体组织微环境（如缺血再灌注、感染、肿瘤或损伤器官）中，组织驻留巨噬细胞（tissue-resident macrophages, RTMs） 与 单核来源巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MDMs） 在发育谱系、模式识别受体（Pattern-Recognition Receptors, PRRs）及死亡受体表达上存在本质差异，决定了其高度的细胞死亡异质性。传统磁珠分选（Magnetic-Activated Cell Sorting, MACS）或流式细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）会将细胞剥离体内其微环境多信号分子的协同调控，改变细胞真实的死亡状态（state）。研究范式升级的核心在于：依托高维流式细胞术进行免分选近原生解析，在靶器官混合细胞池中，定量体内组织巨噬细胞亚群细胞死亡状态的 信号受体/PRR—启动分子—执行分子三阶死亡功能轴（在四层标志物体系中，第 1 层细胞身份先锁定 RTMs/MDMs，其后第 2–4 层即构成该三阶功能轴）。配合 活细胞门控（Live Gating） 剔除死细胞非特异吸附，直接测定 MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白，Mixed Lineage Kinase Domain-Like protein）膜易位、GSDME-NT / GSDMD-NT（Gasdermin E / Gasdermin D 氨基端活性片段）、活化型 Caspase-3（cleaved caspase-3） 及铁死亡相关 GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶 4）MFI（中位数荧光强度）。按照 现象（Bulk 研究基础）—> 高维流式确证细胞亚群死亡表型 —> 单细胞组学探索机制 —> 细胞模型单因素归因的四步研究逻辑链，将高维流式与单细胞多组学（scRNA-seq 与 scATAC-seq）正交验证，是构建 2027 国自然基金高创新性与严密证据链的重要策略之一。
实体组织中的巨噬细胞死亡并非随机发生的同质化事件，而是由 发育谱系分化 × 病理微环境信号 × 死亡通路交叉对话（crosstalk） 共同决定的单细胞连续谱系过程。
组织驻留巨噬细胞（RTMs）：起源于胚胎期（卵黄囊或胎肝），具有自我更新能力，表达特定的驻留标记（如肺泡巨噬细胞 Siglec-F+、肝脏 Kupffer 细胞 Clec4f+、心肌/肾脏 Tim-4+ CD64+）。RTMs 的表观遗传图谱（scATAC-seq 可见其特定死亡基因启动子区处于预致敏（Priming）或关闭状态）决定了其在稳态下对死亡信号的高抵抗性；
单核来源巨噬细胞（MDMs）：病理状态下由骨髓产出并募集至损伤组织（CD11b+ Ly6C+ CD64+）。MDMs 高表达多种模式识别受体（PRRs，如 TLR4、NLRP3）与死亡受体（TNFR1、Fas），在收到病原相关分子模式（PAMPs）/损伤相关分子模式（DAMPs）刺激后极易启动死亡程序。
病理组织中充斥着复杂的理化与免疫信号梯差：
低氧与脂质过氧化区域优先诱发巨噬细胞 铁死亡（Ferroptosis，GPX4 / SLC7A11 MFI 显著下调）；
高浓度 TNF-α + IFN-γ 或病原体感染区域则诱导 PANoptosis（一种同时涉及细胞焦亡、细胞凋亡与坏死性凋亡多条途径的炎性细胞死亡）。
在单细胞分辨率下解析组织巨噬细胞死亡，能够回答：在疾病不同病程中，究竟是 RTMs 崩解还是 MDMs 优先死亡？这种死亡如何改变组织微环境的促炎/消炎命运？这是高水平期刊与国自然持续关注的前沿方向之一。
其一（知识空白切入点），Park 等（Cell）Figure 3 图注揭示了一项关键研究空白：稳态下 RTMs 可源于胚胎或单核细胞；疾病期损伤信号募集血液单核细胞并促其分化为 MDMs（mo-macs），但疾病进展期这些 MDMs 究竟直接死亡还是回复为真正的 RTM 表型尚不清楚。这一空白蕴含三个维度的未解问题——死亡方式：RTMs 与 MDMs 分别经细胞凋亡、细胞焦亡、坏死性凋亡或铁死亡哪条通路走向终末，缺乏亚群层面的直接证据；死亡时序：两类细胞在进展期与消退期的死亡节点是否错位；增殖与死亡的动态演变：MDMs 经募集并局部增殖而来，其消退期命运（清除还是驻留）决定炎症能否真正消退。这些问题在整体组织水平难以回答，恰需单细胞分辨率的流式功能终态检测：以 MLKL 膜易位（MLKL-mem）、GSDME-NT / GSDMD-NT、cleaved caspase-3 区分死亡通路，以铁死亡 GPX4 / SLC7A11 MFI 评估铁死亡易感性，从而在亚群维度厘清谁、在何时、以何种方式死亡。需要强调的是，此类观测仅建立相关联系，死亡通路与疾病转归之间的因果关系仍需功能学验证。
其二（疾病意义切入点），坏死性凋亡与细胞焦亡在疾病中呈现组织与细胞类型特异的双面性：在细菌、真菌与病毒感染的宿主防御中，MLKL-mem介导的坏死性凋亡与 GSDMD-NT / GSDME-NT 打孔介导的细胞焦亡以保护作用为主；而在脓毒症、自身免疫性关节炎、IBD、脂肪性肝炎与动脉粥样硬化等慢性炎性与代谢性疾病中，则多呈促病效应（图 3）。现有证据多来自全身性或细胞特异敲除小鼠，因坏死效应蛋白的功能冗余、细胞类型依赖与通路 backup 机制，结论常相互矛盾；且疾病中坏死蛋白表达/活化升高仅为相关性证据，并不等同于因果贡献。因此，在单细胞分辨率下厘清 RTMs 与 MDMs 各自发生何种形式的坏死性死亡（MLKL-mem或 GSDME-NT / GSDMD-NT），是建立亚群—死亡形式—疾病结局因果链条的前提，也是本实操专篇的核心科学价值所在。
在四层标志物体系中，第 1 层细胞身份先锁定 RTMs/MDMs，其后第 2–4 层即构成 信号受体/PRR—启动分子—执行分子三阶死亡功能轴。传统的 WB 仅能检测某种执行蛋白是否切割生成活性片段，无法建立完整的上游信号与下游执行的归因链条。高维流式通过多色 Panel 设计，可在单个巨噬细胞上同步贯穿三个层级：
第 1 阶（信号受体/PRRs，对应四层之第 2 层）：评估病理微环境下，巨噬细胞表面的模式识别受体（TLR4、NLRs）及死亡受体（TNFR1/2、Fas）表达量；
第 2 阶（启动/调节分子，对应四层之第 3 层）：测定上游启动复合物（NLRP3、cleaved caspase-8）及抗死亡蛋白（Bcl-2、GPX4）；
第 3 阶（执行分子，对应四层之第 4 层）：在早期执行期/细胞裂解前期，直接测定 MLKL-mem、GSDME-NT / GSDMD-NT 活性片段、cleaved caspase-3 等功能终态。
除三阶功能轴外，高维流式还能在单细胞层面同时解析亚群内的蛋白表达差异——以细胞凋亡为例，同时区分 cleaved caspase-3+ 与 cleaved caspase-3- 两个亚群，并分别定量其抗凋亡蛋白 Bcl-2 与执行蛋白 cleaved caspase-3 的表达（图 4、图 5）：与对照组相比，处理组 cleaved caspase-3- 亚群的 Bcl-2 MFI 显著下调（1205 → 996/1077），而 cleaved caspase-3+ 亚群的 cleaved caspase-3 MFI 显著高于 cleaved caspase-3- 亚群，直观呈现凋亡执行程序在单细胞亚群层面的启动。
在实体组织中研究细胞死亡状态（state），主要的技术挑战之一在于 分选过程对微环境信号链的破坏：
传统磁珠富集（MACS）与 FACS 分选的主要局限：物理分选需要经过长时间的温育、离心剪切力与高压喷嘴挤压。更重要的是，一旦通过磁珠或分选将巨噬细胞从组织中剥离，细胞就瞬间脱离了体内原位的旁分泌（Paracrine）微环境——失去了病理组织中高密度的 DAMPs、PAMPs、低氧梯度以及细胞因子多信号分子的实时协调作用。失去微环境支撑的细胞，其死亡程序可能会中断、发生人为衰退，甚至因分选应激产生伪阳性，难以准确还原组织巨噬细胞亚群真实的信号受体—启动分子—执行分子功能轴；
免分选（Sorting-Free）近原生策略：组织解离后，无需物理分选，直接在靶器官单细胞悬液池中，利用分型标志物圈门（Gating）锁定 RTMs 与 MDMs 亚群。这一策略在较短时间内锁定细胞在离开体内瞬间的真实状态（state），尽可能还原体内原生状态；
抗组织解离伪影：单细胞转录组（scRNA-seq）在 37°C 消化过程中可能诱导即刻早期基因（Immediate-Early Genes, IEGs，如 Fos、Jun）的转录假象；蛋白磷酸化（如磷酸化 MLKL（p-MLKL））易发生快速去磷酸化。流式选择的检测靶点为稳定不可逆的执行蛋白活性片段与膜易位，解离过程对其干扰较小，能更贴近体内（in vivo）真实发生的死亡状态。
在高水平期刊（如 Cell、Immunity）及国自然评审中，单凭单一组学或单纯流式往往难以构建完整的学术说服力。将高维流式细胞术与单细胞转录组（scRNA-seq）、单细胞表观组（scATAC-seq）进行正交验证，是维尔凯推荐的研究策略之一：
scRNA-seq 的机制探索：scRNA-seq 能提示某一巨噬细胞亚群高表达 Casp3、Gsdmd、Mlkl 或 Gpx4 的 mRNA，但 mRNA 丰度并不直接等同于蛋白质活化或膜打孔，且消化应激产生的 IEGs 会干扰判断；
流式的正交验证：利用高维流式在相同的巨噬细胞亚群（匹配相应表面 Marker）中，测定 cleaved caspase-3、GSDME-NT / GSDMD-NT 活性片段、MLKL-mem及 GPX4 MFI，直接将转录组推测的死亡倾向确证为单细胞蛋白质水平的死亡表型。
scATAC-seq 的表观探索：scATAC-seq 能揭示 RTMs 与 MDMs 在染色质可及性上的差异（例如发现 MDMs 的 Nlrp3 或 Tnfrsf1a 启动子区开放度更高）；
流式的正交验证：高维流式能够直接验证这种染色质预开放（Priming）是否与病理刺激下 MDMs 细胞内启动分子（NLRP3、Caspase-8）的表达增加，以及最终细胞焦亡/PANoptosis 执行蛋白活性片段的产生相关。
针对 2027 国自然申报，课题组应摆脱为了做组学而做组学的机械堆叠、缺乏逻辑主线的倾向。维尔凯提炼出符合国自然评审偏好的四步研究逻辑链：
研究内容：利用全组织匀浆 Western blot、免疫组化（IHC）或 ELISA，在病理模型（如缺血再灌注、感染、肿瘤）中发现组织存在整体的细胞死亡（如检测到总 cleaved caspase-3 或总 GSDMD-NT 活性片段表达上升）或炎症因子释放。这构成了课题的初步研究基础。
研究内容：采用维尔凯的细胞死亡流式 Panel，直接在靶器官混合单细胞悬液中，解析 RTMs 与 MDMs 亚群的信号受体—启动分子—执行分子功能轴，确证到底是 RTMs 还是 MDMs 发生了何种细胞死亡表型及时序性（如 MDMs 优先发生 GSDME-NT 活性片段与 MLKL-mem共存的 PANoptosis，而 RTMs 呈现 GPX4 / SLC7A11 MFI 下调的铁死亡）。
研究内容：在流式确证了目标巨噬细胞亚群及其细胞死亡表型后，针对性地联用单细胞转录组（scRNA-seq）与单细胞表观组（scATAC-seq）。重点分析该死亡亚群的上游关键转录因子（Transcription Factors, TFs）、信号通路富集（如 JAK/STAT1、NF-κB）以及染色质可及性变化，揭示驱动该细胞死亡表型重塑的深层分子机制。
研究内容：将体内复杂微环境简化，回归体外巨噬细胞模型（骨髓来源巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDM）或 RAW264.7）。利用第 3 步筛选出的关键靶点进行基因敲除（Knockout, KO）、过表达或小分子抑制剂干预，验证其对受体—启动分子—执行分子（MLKL-mem/活性片段/铁死亡三轴）功能轴的直接调控作用，完成单因素归因的逻辑闭环。
免分选近原生解析：靶器官混合单细胞悬液直接解析 RTMs 与 MDMs 亚群的信号受体—启动分子—执行分子功能轴，减少对 MACS/FACS 物理分选的依赖，避免脱离微环境导致死亡状态（state）人为改变。
抗组织解离伪影：选择非 IEGs、非瞬态磷酸化的稳定效应蛋白（活性片段与膜易位），降低消化应激带来的转录与表观假象。
四步研究逻辑链：遵循现象（Bulk）—> 流式确证亚群表型 —> 单细胞组学挖机制 —> 细胞模型单因素归因的严密逻辑，打造 2027 国自然高质量申请书。
| 评价维度 | Western Blot (WB) | 单细胞转录组 (scRNA-seq) | 单细胞表观组 (scATAC-seq) | 高维流式细胞术 (维尔凯四层 Panel) |
|---|---|---|---|---|
| 检测层级 | 组织裂解液总蛋白 | 单细胞 mRNA 转录表达 | 单细胞染色质可及性 | 单细胞蛋白质功能终态 |
| 亚群分辨率 | 无（丧失亚群信息） | 单细胞分辨率 | 单细胞分辨率 | 单细胞分辨率（分型RTMs/MDMs） |
| 组织解离伪影 | 无（直接匀浆） | 极高（诱发 IEGs 假象） | 中等 | 极低（检测稳定效应蛋白与活性片段） |
| 功能终态验证 | 终末累积总量 | 无法反映蛋白活性片段/膜易位 | 无法反映蛋白表达与活化 | 直接测定质膜打孔/活性片段/GPX4 MFI |
| 免分选近原生检测 | 否（匀浆丧失空间） | 需高活性悬液，易失真 | 需高活性悬液 | 是（靶器官混合池直接解析，保留微环境细胞亚群的细胞死亡状态） |
| 铁死亡解析 | 全组织蛋白平均量 | 仅 mRNA 相对丰度 | 转录因子结合位点开放 | 单细胞定量铁摄取-脂质氧化-氧化还原三轴关键蛋白的 MFI |
南宁维尔凯生物科技有限公司专注于高维流式细胞术与单细胞多组学在组织样本检测及细胞死亡领域的创新应用。我们依托项目特异Panel 设计与全流程高维流式技术服务，为广大科研工作者提供一站式技术服务：
高维流式技术服务：围绕信号受体/PRR—启动分子—执行分子功能轴，构建针对小鼠/人源实体组织（肺、肝、肾、肿瘤、心肌等）的四层标志物 Panel，涵盖多种调节性死亡程序的核心指标；
流式与单细胞多组学联合研究：提供从高维流式表型确证、单细胞转录组（scRNA-seq）/表观组（scATAC-seq）数据验证，到体外细胞模型单因素归因验证的全流程服务；
2027 国自然申报深度赋能：协助课题组按照现象—>流式确证—>组学机制—>单因素归因的四步链条梳理申请书，打造符合 Cell、Immunity 等高水平期刊要求的严密逻辑闭环。
[1] Karki R, Sharma BR, Tuladhar S, et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 2021;184(1):149-168.e17. doi:10.1016/j.cell.2020.11.025
[2] Fritsch M, Günther SD, Schwarzer R, et al. Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis. Nature. 2019;575(7784):683-687. doi:10.1038/s41586-019-1770-6
[3] Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012;149(5):1060-1072. doi:10.1016/j.cell.2012.03.042
[4] Jiang X, Stockwell BR, Conrad M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021;22(4):266-282. doi:10.1038/s41580-020-00324-8
[5] Bell HN, Stockwell BR, Zou W. Ironing out the role of ferroptosis in immunity. Immunity. 2024;57(5):941-956. doi:10.1016/j.immuni.2024.03.019
[6] Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375(6586):1254-1261. doi:10.1126/science.abf0529
[7] Liu X, Nie L, Zhang Y, et al. Actin cytoskeleton vulnerability to disulfide stress mediates disulfidptosis. Nat Cell Biol. 2023;25(3):404-414. doi:10.1038/s41556-023-01091-2
[8] Shi J, Zhao Y, Wang K, et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 2015;526(7575):660-665. doi:10.1038/nature15514
[9] Wang Y, Gao W, Shi X, et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 2017;547(7661):99-103. doi:10.1038/nature22393
[10] Epelman S, Lavine KJ, Randolph GJ. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 2014;41(1):21-35. doi:10.1016/j.immuni.2014.06.013
[11] Ginhoux F, Greter M, Leboeuf M, et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 2010;330(6005):841-845. doi:10.1126/science.1194637
[12] van den Brink SC, Sage F, Vértesy Á, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936. doi:10.1038/nmeth.4437
[13] Sun L, Wang H, Wang Z, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-227. doi:10.1016/j.cell.2011.11.031